Fizikai Tudományok Doktori Iskola   

BME TTK, Fizika Tanszék/Fizikai Intézet

Témavezető: Dr. Kézsmárki István

A malária magneto-optikai diagnózisa

A kutatási téma néhány soros bemutatása

A malária még napjainkban is a Föld egyik legtöbb halálos áldozatot követelő fertőző betegsége annak ellenére, hogy megfelelő gyógyszeres kezeléssel szinte minden esetben gyógyítható lenne. A sikeres gyógyítás kulcsa ugyanakkor a korai és pontos diagnózis, ami a legsúlyosabban érintett fejlődő országokban sokszor nem elérhető a szakmai vagy anyagi erőforrások hiánya miatt. Kutatási munkám legfőbb célja egy olyan, mágneses és optikai elven működő eszköz kifejlesztése, ami alkalmas a malária érzékeny, de olcsón kivitelezhető diagnosztizálására.

 

A kutatóhely rövid bemutatása

Kutatásaimat a BME Fizika Tanszékének Magneto-optikai spektroszkópia laboratóriumában folytatom. Csoportunk kutatási profilja a magneto-optikai spektroszkópia eszköztárának alkalmazása a legújabb anyagcsaládok egzotikus mágneses és optikai tulajdonságainak feltárására, valamint biológiai célú alkalmazásokra. A maláriadiagnosztikai berendezés fejlesztését itt kezdtük el, a sejtkultúrás teszteléseket a portugál IMM és az ausztrál UWA sejtlaboratóriumában végeztem.

 

A kutatás történetének, tágabb kontextusának bemutatása

A maláriafertőzés a Föld, népességének közelítőleg felét érintő, súlyos emberi és anyag áldozatokat követelő egészségügyi problémája még napjainkban is. A WHO adatai szerint 2014-ben a regisztrált megbetegedések száma 200 millió, a halálos áldozatoké pedig 584 ezer volt. Ennek megfelelően a malária elleni küzdelem a WHO egy kiemelt stratégiai területe. A 2015-ben elfogadott tervezet egyik legfontosabb célkitűzése a megelőzési programok, valamint gyógyszer- és vakcinafejlesztés támogatása mellett [1], a diagnosztika teljes körű elérhetőségének biztosítása a legszegényebb és leginkább fenyegetett területeken. Ennek kulcsa ugyanakkor egy olyan költséghatékony, szakértelmet nem igénylő és automatizálható eljárás kifejlesztése, amelynek segítségével a betegség érzékenyen, de olcsón kimutatható. A ma elterjedt diagnosztikai módszerek ugyanis vagy szakképzett munkaerőt igényelnek (mikroszkópos vizsgálat), vagy egységáruk túl magas (diagnosztikai gyorstesztek - RDT).

 

 

1. ábra. A Föld malária sújtotta területei (WHO)

 

Kutatócsoportunkkal egy olyan eljárás megvalósíthatóságát vizsgáljuk, amely tisztán fizikai detektálási elven (költséges biokémiai reagensek nélkül) képes kimutatni a kórokozók jelenlétét a fertőzött vérmintában a betegség melléktermékén, a maláriapigmenten (hemozoin) keresztül.

A maláriapigment az összetett lefolyású maláriafertőzés ún. vér fázisában, az első tünetek megjelenésével egyidejűleg jön létre a páciensek véráramában [2] és egyedi, ugyanakkor minden esetben jelen lévő indikátora a betegség kialakulásának. Mindemellett különleges mágneses és optikai tulajdonságokkal rendelkezik [3], így ideális diagnosztikai célpontnak bizonyul. Biomarkerként való alkalmazását több tanulmány is felvetette az utóbbi években. [4-8].

 

 

2. ábra. A malária fertőzés életciklusai. Jobbra: hemozoin termelődés a paraziták emésztővakuólumában (elektronmikroszkópos felvétel).

A kutatás célja, a megválaszolandó kérdések

A hemozoin mágneses optikai detektálásának lehetőségét először laboratóriumi szintű berendezéseken vizsgáltam. A hordozható, olcsóbb műszer optimális fizikai paramétereinek meghatározásához (mágneses tér nagysága, alkalmazott lézer hullámhossza) először a hemozoin optikai és mágneses anizotrópiáját tanulmányoztam [A].

A mágnesezettség és optikai spektroszkópiai mérések tapasztalatai alapján kollégáimmal megépítettük a berendezés hordozható prototípusát, majd annak minősítésébe kezdtünk. A minősítés során a legegyszerűbb modelltől a valós terepi tesztek felé haladva a tervezett lépések a következők voltak:

 

(i)  Validálás szintetikus hemozoin kristályok szuszpenziójával vérben [A]
(ii)  Mérés biológiai mintán, sejttenyészetekből származó fertőzött véren [B]
(iii)  Mérés biológiai mintán, élő, fertőzött egértől származó véren [C]

 

A minősítés utolsó lépése, melyet a közeljövőben tervezünk megvalósítani:

 

(iv) Validálás terepi diagnózissal, fertőzött betegek véréből
 

A műszerfejlesztés mellett a maláriakutatás egyéb területein is hasznos, új eredmények elérését tűztük ki célul. A maláriapigment fizikai tulajdonságainak beható feltérképezése már a fejlesztés hozadékaként megvalósult [A]. A berendezés továbbá gyors és költséghatékony alternatívát kínál maláriagyógyszer-hatékonyság tesztelésre [B]. Ezen kívül módszerünkkel pontosan mérhető a hemozoin felhalmozódási és kiürülési rátája a fertőzés során, ami szintén komoly érdeklődésre tarthat számot [9]. Ennek megfelelően nagy volumenű gyógyszertesztek elvégzése, valamint a hemozoinkinetikát érintő alapkutatás is későbbi céljaink között szerepel.

Módszerek

A hemozoin mágneses alapú detektálását az teszi lehetővé, hogy a kristály alapegységét képező porphyrin gyűrűk központjában lévő vasion magas vegyértékű, paramágneses, azaz mágnesezhető állapotba kerül, szemben a vérben természetesen előforduló diamágneses állapotú vassal. 

 

 

3. ábra. Hemozoin kristályok morfológiája elektronmikroszkópos felvételen (bal), és kristályszerkezete (középen). A kristály elemi cellája egy két porphyrin gyűrűből (jobb) álló dimer.

 

A kristályok alacsony szimmetriájának következtében fellépő lineáris dikroizmus,– azaz a kristályra bocsátott fény polarizációs irányától függő transzmisszió – ad módot a kristályok optikai azonosítására a vérben. Ahhoz, hogy a vérmintában lévő összes kristály hatása egymást erősítve adódjon össze, a kristályok optikai főtengelyeinek azonos irányban kell állnia. A kristályok rendezésére azok mágneses anizotrópiája biztosít lehetőséget, mely révén külső mágneses tér hatására egy irányba fordulnak. A mágnesesen rendezett kristályokra bocsátott, a mágneses térrel párhuzamosan, illetve arra merőlegesen polarizált lézerfény transzmittált intenzitása között a kristályok lineáris dikroizmusa miatt különbség lép fel. A különbségi intenzitás arányos a vérben felhalmozódott maláriapigment kristályok mennyiségével, így a betegség előrehaladása számszerűsíthető. 

 

 

4. ábra. A hemozoin magneto-optikai detektálási elvének egyszerű szemléltetése.

 

A betegség korai stádiumában történő kimutatásához a maláriapigment rendkívül érzékeny detektálása szükséges. Ezért a berendezés megvalósításánál modulációs méréstechnikát célszerű alkalmazni. A fent vázolt mérési alapelvet más kutatócsoportok is felvetették [6], de a mágneses tér modulációjából eredően az általuk épített berendezés  túlságosan költséges és nagyméretű volt ahhoz, hogy a klinikai gyakorlatban elterjedhessen. 

Az általunk kifejlesztett forgómágneses diagnosztikai berendezés (RMOD) működésének alapja, hogy a mágneses tér erőssége helyett annak irányát változtatjuk. Ezt egy speciális, állandó mágnesekből álló gyűrű (ún. Halbach-elrendezés) forgatásával valósítottuk meg. A mágneses tér forgását követve a vérmintában lévő maláriapigment kristályok is forognak. A mintán átbocsátott polarizált lézerfény függőleges és vízszintes polarizációjú komponense – a kristályok aktuális irányának változása miatt – egymással ellentétes fázisban váltakozó intenzitással jut át. Egy Wollaston-prizma segítségével térben elválasztjuk egymástól a két polarizációs komponenst, és a kettő közti intenzitás különbséget egy ún. kiegyenlített fotodióda

híd segítségével mérjük.

 

5. ábra. A forgómágneses maláriadiagnosztikai berendezés (RMOD) működési elve.

 

Az így megvalósított eljárás nagy pontosságú mérést tesz lehetővé, amely révén akár a teljes fényintenzitás egy milliomod részének megfelelő változás is érzékelhető, így 1 ml vérben akár 10 pg hemozoin is kimutatható [A]. Emellett a berendezés olcsó, könnyen hozzáférhető optikai elemeket, egy hagyományos lézerdiódát, valamint egy állandó mágnest tartalmaz, ezáltal a gyártási költség elegendően alacsony lehet ahhoz, hogy a ma alkalmazott diagnosztikai módszerek egy alternatívájaként léphessen fel. A műszer mérete leskálázható továbbá annyira, hogy könnyen szállítható egységként terepi diagnózisra is alkalmas legyen.

 

Eddigi eredmények

A kutatás kezdeti stádiumában a hemozoin fizikai tulajdonságait tanulmányoztam. A SQUID-del végzett mágnesezettség méréseim eredményei alátámasztották a hemozoin könnyű síkú paramágneses viselkedését. A kristályok rendeződésének mágneses tértől való függését a mágnesesen indukált lineáris dikroizmus erősségén keresztül vizsgáltam. A kísérletek szerint a mágneses rendezéshez az állandó mágnesekkel könnyedén elérhető 0,5-1 T mágneses tér is elegendő. A tapasztalataink [A] egybevágnak más csoportok mágneses rezonancia méréseivel [10], valamint továbblépést jelentenek a mágneses rendeződésről alkotott korábbi elképzelésekhez képest [6].

A kristályok mágnesesen indukált lineáris dikroizmus spektrumát a laboratóriumunkban összeállított spektrométerrel vizsgáltam polarizációmodulációs technika alkalmazásával.  A lineáris dikroizmus csúcsok spektrális helyét, valamint a vér hullámhosszfüggő átlátszóságát alapul véve, a diagnosztikai berendezéshez használt lézerfény optimális hullámhosszát 680 nm közeli tartományban határoztam meg.

 

 

6. ábra. Balra: A kristályok rendeződésének mágneses térfüggése. Fent: a hemozoin kristályok nehéz mágnesezési tengelyének (hard axis) térbeli eloszlása növekvő mágneses terek hatására. Lent: a mért magneto-optikai jel amplitúdója a mágneses tér erősségének, azaz a kristályok rendezettségének függvényében. Jobbra: hemozoin szuszpenziók (S: fiziológiás sóoldat, P: vérplazma, B: teljes vér) lineáris dikroizmus spektruma.

 

A hemozoinról szerzett ismereteink alapján megépítettük a diagnosztikai berendezés prototípusát. A műszer validálásának első lépését szintetikus hemozoin kristályok [11] szuszpenzióján végeztem, először vízben, majd vérben. Hígítási sorok mérésével meghatároztam a legkisebb kimutatható hemozoin-koncentrációt, mely vízben 0,5-1 pg/ml, míg vérben ~10 pg/ml volt. Ilyen alacsony hemozoin mennyiségek a fertőzés legkorábbi stádiumában jellemzők, és az ezeknek megfelelő becsült parazitaszám alapján a berendezés detektálási hatékonysága meghaladja a gyorstesztekét és eléri a mikroszkópos vizsgálatok teljesítményét [A].

 

 

7. ábra. Különböző koncentrációjú hemozoin szuszpenziók magneto-optikai jele a mágnes fordulatszámának függvényében. A görbéket a megfelelő koncentráció értékekkel normalizálva ábrázoltuk a linearitás szemléltetése céljából.

 

A műszer tesztelésének második fázisában már P. falciparum parazita sejtkultúrákkal fertőzött, természetes hemozoint tartalmazó vérrel dolgoztunk, melyeket a WEHI maláriakutató-intézet munkatársai bocsátottak a rendelkezésünkre. Az eltérő egyedfejlődési stádiumokat, és ezáltal a természetben előforduló Plasmodium fajokat reprezentáló mintákon mért magneto-optikai jel a várakozásoknak megfelelően széles tartományon arányos volt a parazita-koncentrációval és a paraziták életciklusának előrehaladottságával is. A paraziták koncentrációjának kimutathatósági határa fiatal ring kultúrák esetén 0.0008%, míg az idősebb schizontokat tartalmazó mintáknál 0.0002% volt [B], melyek a betegség nagyon korai stádiumára jellemző  parazitémia-értékek.

8. ábra. Validációs mérések P. falciparum paraziták két életszakaszából származó (A és B) kultúrákból készített hígítási sorokon. Balra: a paraziták koreloszlása a két törzsmintában. Jobbra: a detektált magneto-optikai jel és a hígított minták parazita-sűrűségének kapcsolata.

 

A validálás harmadik lépéseként egy valós diagnosztikai szituációt modelleztünk egérkísérletekkel. Az egereket szúnyogok által terjesztett parazita-formákkal (sporozoite) fertőztük meg, majd adott időközönként vérmintát vettünk tőlük. A vérmintákat különféle diagnosztikai módszerekkel teszteltük, és azt vizsgáltuk, hogy melyik az a legkorábbi időpont, amelytől az egyes módszerek már képesek kimutatni a paraziták jelenlétét a fertőzött egyedekben. A tesztek során a magneto-optikai módszer ugyan a rendkívül érzékeny és költséges PCR érzékenységét nem érte el, de a diagnosztikai gyakorlatban sztenderdként használt mikroszkópiánál és az áramlásos citometriánál lényegesen jobban teljesített. Gyógyításos egérkísérletek során azt is megállapítottuk, hogy a módszer alkalmas gyógyult egyedek újbóli megfertőződésének kimutatására egy néhány napos átmeneti időszak elteltével [C] .

 

 

9.ábra. Balra: a malária fertőzés előrehaladásának követése fertőzött egereken az RMOD berendezéssel. Jobbra: gyógyszeresen kezelt fertőzött egerek gyógyulásának követése az RMOD berendezéssel.

 

A lisszaboni IMM kutatóintézetben üzembe helyezett prototípus segítségével élő, in vitro fenntartott malária-sejtkultúrákon is teszteltük a módszer hatékonyságát. Azt tapasztaltuk, hogy a magneto-optikai műszerrel a paraziták egyedfejlődése érzékenyen, nagy időfelbontással nyomon követhető a növekvő mennyiségben termelt hemozoin koncentrációjának mérésén keresztül. Ennek köszönhetően a műszer kiválóan alkalmazható gyógyszermolekulák növekedésgátló hatásának tesztelésére a potenciális diagnosztikai alkalmazás mellett [B].

 

Várható impakt, további kutatás

Az RMOD malária-diagnosztikai műszer fejlesztése az utolsó validálási fázisba érkezett. A műszer első prototípusát sikeresen teszteltük a legegyszerűbb szintetikus mintáktól kezdve in vivo egérkísérletekig az összes olyan malária-modellen, amely laboratóriumban megvalósítható. Előzetes eredményeink alapján a műszer alkalmazható továbbá egyéb, anizotróp mágneses részecskék detektálására is [12].

A publikált kutatási eredményeink jelentős sajtóvisszhangot váltottak ki, valamint ipari és akadémiai kutatási együttműködéseket eredményeztek neves maláriakutató-intézetekkel. Ezen együttműködéseknek köszönhetően két irányvonalon is folytatni tudjuk a műszerfejlesztést: (i) egyrészt a lisszaboni IMM kutatóintézetbe szállított prototípussal nagy volumenű  gyógyszertesztek megvalósításába kezdtek kollégáink malária sejtkultúrákon; (ii) másrészt klinikai tesztek elvégzését tervezzük maláriafertőzött-területeken (India és Thaiföld) 2015 őszén.

Saját publikációk, hivatkozások, linkgyűjtemény

Kapcsolódó saját publikációk listája:

[A] Butykai A, Orbán A, Kocsis V, Szaller D, Bordács S, Tátrai-Szekeres E, Kiss LF, Bóta A, Vértessy BG, Zelles T and Kézsmárki I: Malaria pigment crystals as magnetic microrotors: Key for high sensitivity diagnosis. SCIENTIFIC REPORTS 3: Paper 1431. 10 p. (2013)

 

[B] Orbán A, Butykai A, Molnar A, Prohle Z, Fulop G, Zelles T, Forsyth W, Hill D, Muller I, Schofield L, Rebelo M, Hanscheid T, Karl S and Kezsmarki I: Evaluation of a novel magneto-optical method for the detection of malaria parasites. PLOS ONE 9:(5) p. e96981. (2014)

 

[C] Orbán A, Rebelo M, Albuquerque IS, Butykai A, Kezsmarki I and Hänscheid, T: Efficient monitoring of blood-stage infection in a malaria rodent model by the rotating crystal magneto-optical method. http://xxx.lanl.gov/abs/1505.07792 (2015)

 

Tudományos-ismeretterjesztő cikkek a módszerről:

Physics World, 2012

MIT Technology Review, 2012

Elsevier’s Global Malaria Resource, 2012

Index, 2012; 2014

Hivatkozások listája:

[1] Noedl H, Wongsrichanalai C, Wernsdorfer WH: Malaria drug-sensitivity testing: new assays, new perspectives. Trends Parasitol. 2003, 19(4):175-81.

 

[2] Francis SE, Sullivan DJ, Goldberg DE: Hemoglobin metabolism in the malaria parasite plasmodium falciparum. Annu Rev Microbiol. 1997, 51:97–123.

 

[3] Egan TJ: Physico-chemical aspects of hemozoin (malaria pigment) structure and formation. J of Inorg Biochem. 2002, 91:19–26

 

[4] Rebelo M, Shapiro HM, Amaral T, Melo-Cristino J, Hänscheid T: Haemozoin detection in infected erythrocytes for Plasmodium falciparum malaria diagnosis—Prospects and limitations. Acta Trop. 2012, 123:58 – 61

 

[5] Karl S, David M, Moore L, Grimberg BT, Michon P,  Mueller I, Zborowski M Zimmerman PA: Enhanced detection of gametocytes by magnetic deposition microscopy predicts higher potential for plasmodium falciparum transmission.  Malar J.  2008, 7:66.

 

[6] Newman DM, Heptinstall J, Matelon RJ, Savage L, Wears ML, Beddow J, Cox M, Schallig HD, Mens PF: A magneto-optic route toward the in vivo diagnosis of malaria: preliminary results and preclinical trial data. Biophys. J. 2008, 95:994–1000.

 

[7] Mens PF, Matelon RJ, Nour BYM, Newman DM, Schallig H: Laboratory evaluation on the sensitivity and specificity of a novel and rapid detection method for malaria diagnosis based on magneto-optical technology (MOT). Malar J.  2010, 9:207.

 

[8] Lukianova-Hleb EY, Campbell KM, Constantinou PE, Braam J, Olson JS, Ware RW, Sullivan DJ Jr, Lapotko DO: Hemozoin-generated vapor nanobubbles for transdermal reagent- and needle-free detection of malaria. Proc Nat Acad Sci USA 2013, 11:900-905.

 

[9] Day NPJ, Pham TD, Phan TL et al., “Clearance kinetics of parasites and pigment-containing leukocytes in severe malaria,” Blood 1996, 88(12):4694–4700.

 

[10] Sienkiewicz, A, Krzystek J, Vileno B, Chatain G, Kosar AJ, Bohle DS, Forró L: Multi-frequency high-field EPR study of iron centers in malarial pigments. J. Am. Chem. Soc. 2006,128:4534–4535.

 

[11] Egan TJ, Hempelmann E, Mavuso WW: Characterisation of synthetic b-haematin and effects of the antimalarial drugs quinidine, halofantrine, desbutylhalofantrine and efloquine on its formation. J. Inorg. Biochem. 1999,  73:101–107.

 

[12] Ceolin G, Orban A, Kocsis V, Gyurcsanyi RE, Kezsmarki I and Horvath V: Electrochemical template synthesis of proteinimprinted magnetic polymer microrods. JOURNAL OF MATERIALS SCIENCE 48:(15) pp. 52095218. (2013)