 |
BMe Kutatói pályázat |
|
Villamosmérnöki és Informatikai Kar
Elektronikai Technológia Tanszék
Érzékelők és mikrofluidika labor
Multi-bioérzékelő alapú eszközök és egyéb mikrofluidikai alkalmazások kutatás-fejlesztése
A kutatási terület néhány soros bemutatása
A bioérzékelők és a mikrofluidikai alkalmazások is a tudományos világ egy-egy gyorsan növekvő témakörét képezik. A DNS-alapú bioszenzorok egyre inkább az érdeklődés középpontjába kerülnek, az olyan lehetséges széles körű felhasználási területeknek köszönhetően, mint a génelemzés, diagnosztika, vagy környezetmonitorozás. A kutatás-fejlesztés iránya ezeken a területeken több szintű: új receptorkonstrukciók segítségével a cél a detektálható molekulák körének kiterjesztése, emellett a már létező és működő elvek esetén a cél a szenzorok paramétereinek (detektálási küszöb, érzékenység, szelektivitás) javítása, illetve az elvek integrálása point-of-care vagy laboratóriumi diagnosztikai berendezésekbe. [Harsányi, G.: Érzékelők az orvosbiológiában c. BME jegyzet; Harsanyi, G.: Sensors in Biomedical Applications, Technomic Publishing Co, Lancaster (USA), 2000, 350 oldal].
A kutatóhely rövid bemutatása
Az Érzékelők és Mikrofluidika Laboratóriumban az 1990-es évek vége óta folyik kémiai és fizikai elvű szenzorok fejlesztése. A labor vezetését a tanszékvezetővé megválasztott Prof. Harsányi Gábortól 2004-ben Dr. Sántha Hunor vette át, aki orvosként és egészségügyi mérnökként az orvosbiológiai és bioérzékelők alkalmazott kutatás-fejlesztését honosította meg, amely irányzat mára a labor elsődleges kutatási területévé vált. A laborban a következő kutatási tevékenységek folynak aktívan: 1) kényelmesen viselhető, orvosbiológiai célú vezeték nélküli érzékelők fejlesztése (pl. EKG, pulzoximéter); 2) optikai és elektrokémiai elvű multi-bioérzékelő platformok fejlesztése előzetes mintajelölést nem igénylő protokollokhoz; 3) mikrofluidikai mintakezelő rendszerek kutatása és fejlesztése. Az elmúlt időszakban laborunk aktívan közreműködött számos nemzetközi és hazai projektben, amelyekből a labor által kutatás-fejlesztésre fordított keret az elmúlt négy évre összesítve meghaladta a 460 millió forintot.
A kutatás történetének, tágabb kontextusának bemutatása
Napjainkban egyre fokozódik a tudományos és ipari érdeklődés a bioérzékelők iránt. 2009-ben a bioérzékelők világpiaca kb. 11 milliárd USD forgalmat bonyolított, és 2010-ben a bírált szakfolyóirat-cikkek száma a több ezres nagyságrendet is meghaladja a témakörben. A definíció szerint biológiailag aktív anyagokat alkalmazó érzékelők alkalmazási területe igen szerteágazó. Az enzimeket alkalmazó biokatalitikus elvű bioérzékelők legelterjedtebben használt képviselői a vércukor-érzékelők, melyek glükóz-oxidáz enzim segítségével a vércukor kémiai bontásán keresztül valósítják meg a vércukor-koncentráció mérését. A piacon kapható kézi vércukormérők sokasága ma már mindössze egy csepp vérrel üzemel, így kínál gyors és fájdalommentes diagnosztikai lehetőséget a cukorbetegek számára.
A „véranalízis egy csepp vérből” elv ma már potenciálisan kiterjeszthető lenne más véralkotókra is. Ma több, világszerte folyó kutatás célja olyan hordozható kézi diagnosztikai berendezések fejlesztése, amelyek ezt az elvet alkalmazva a jövőben kiválthatnák a drága és időigényes laboratóriumi vérvizsgálatokat. Az új célmolekulákra érzékeny biorétegek kutatásán, új és érzékenyebb detektálási elvek fejlesztésén vagy ezek készülékekbe történő integrálásán túl a már meglévő és bevált metódusok alapkutatás jellegű fejlesztése is kiemelt fontosságú területet képez. A bioérzékelők érzékenységének növelése, érzékelési tartományuk kiterjesztése, vagy szelektivitásuk és megbízhatóságuk javítása alapvető cél, és a kutatási terület által felvetett problémák megoldásához magas szintű, multidiszciplináris (vegyész/villamos/gépész- mérnöki, biokémikusi, orvosi) tudásra van szükség.
A kutatás célja, a megválaszolandó kérdések
A bioérzékelő eszközök általában egy biológiailag aktív érzékelő részből (receptor) és hozzá szorosan kapcsolódó fizikai-kémiai jelátalakító részből (transzducer) állnak. A receptor feladata, hogy a minta anyagával szelektív módon összekapcsolódjon – bizonyos típusoknál ezen túlmenően reakcióba is lépjen –, a transzduceré pedig, hogy ennek az összekapcsolódásnak/reakciónak hatására elektromos vagy optikai jelet generáljon, amely információt hordoz a kimutatandó anyagok koncentrációjáról.
A bioérzékelők lehetséges kutatások céljai az említett strukturális szétválasztás alapján csoportosíthatók. A bioreceptorok kutatás-fejlesztésének célja egyrészt új célmolekulákra érzékeny receptorrétegek kifejlesztése, illetve a már létező receptorrétegek fejlesztése: a rögzített bioreceptor-molekulák orientációja vagy a bioreceptor-réteg nanoszerkezete például a bioérzékelők egyes fontos paramétereit (pl. érzékenység, regenerálhatóság) döntően befolyásolják.
A transzducerfejlesztés területén cél a jelátalakítási/jeltovábbító elvek fejlesztése a szenzor kritikus paramétereinek (érzékenység, detektálási határ, reprodukálhatóság, kiolvasási idő) javítása érdekében. Ezt a két területet alapkutatás jelleggel is műveljük az Érzékelők és mikrofluidika laboratóriumban.
Ezektől eltérő fejlesztési irány laborunkban az eszköz-szintű fejlesztés, ahol két trendről beszélhetünk. Bizonyos kiolvasási elvek (pl. elektrokémiai) alkalmasak arra, hogy integráltan, Point-of-Care (PoC) eszközökben használjuk őket. Itt cél a mérőeszköz méretének csökkentése (az integráció fokozása), kezelhetőségének javítása (e-Health rendszerkompatibilitás, otthonról kezelhetőség stb.). A másik irány a labordiagnosztikai berendezések fejlesztése ( például SPRi platformunk), ahol a cél a megbízható, nagy áteresztőképességű mérések lehetővé tétele, pl. gyógyszerkutatási alkalmazásokhoz.
Az eszközfejlesztéshez köthető a mintakezelő rendszerek fejlesztése is. Az integráció növelésével és a vizsgálathoz minimálisan szükséges mintamennyiség csökkentésével (pl. minél teljesebb véranalízis egy csepp vérből) a kezelendő térfogatok lecsökkennek, viszont a mérendő vérparaméterek és az analitikai protokollok bonyolultságának növekedésével együtt nő a mintakezelési lépések száma, így az eszközök bonyolultsága is. Emiatt indokolt a mikrofluidikai mintakezelő egységek jelentős továbbfejlesztése.
Napjainkra az egyszer használatos Point-of-Care biominta-elemzések piacán a személyi glükózmérők eldobható rácseppentős tesztcsíkjaihoz képest a mintakezelés két további evolúciós lépésen jutott túl.
1. pl. az ovulációs vagy terhességi tesztek ún. lateral-flow alapú eljárása passzív módon, a diffúzió révén biztosítja a mintában megkeresendő célmolekulák eljuttatását a különböző reakciózónákba (eredményjelző csík, majd ezután pár mm-rel távolabb egy diffúzió-kontroll csík),
2. pl. a Roche Diagnostics CoaguCheck XS készülékében egy kb. 2 cm hosszú egyenes csatorna falainak tervezett mértékű hidrofilitása tereli – szintén passzívan, a kapillárishatás segítségével – a mérőzóna 6 db aranyelektródjához a mintát a vércsepp-beadagoló nyílástól.
További két evolúciós lépés lesz szükséges a fentieknél komplexebb mintakezelést és reagáltatási/mérési protokollt igénylő elemzések Point-of-Care változataihoz. Nevezetesen:
3. aktív mintakezelés a készülékbe épített mikropumpa(ák) segítségével,
4. megbízható, de az egyszer használatos, eldobható eszközökben is tömeggyártásból származó szelepek.
Bár a piacon még nem láthatók az előző bekezdésben leírt 1. és 2. példáknál bonyolultabb PoC készülékek, a 3. és 4. evolúciós lépést is tartalmazó eszközök kutatás-fejlesztése a tudományos érdeklődés középpontjában áll a Lab-on-a-Chip (LoC), a micro Total Analytical Systems (µTAS), a multi-bioérzékelők és a mikrofluidika szakterületeken.
Módszerek
A vizsgálati módszerek között elektrokémiai és optikai eljárások szerepelnek.
Az elektrokémiai módszerek (pl. elektrokémiai impedancia spektroszkópia - EIS) előnye, hogy mérési elve egyszerű, gyors, valamint kisméretű, hordozható, kézi eszközökbe integrálható, amire tökéletes példa a bioérzékelők sikertörténetének számító vércukor érzékelők elektrokémiai verzióinak széles körű elterjedése az optikai elvű régebbi készülékek rovására. Elektrokémiai vizsgálatainkhoz a világszínvonalú PC-vezérelt labor-potenciosztátokat használunk (Voltalab PGZ 301, Voltalab PST 50).
Az általunk kutatott és használt optikai módszer, a felületi plazmon-rezonancia képalkotás (Surface Plasmon Resonance imaging - SPRi) előnye ezzel szemben az, hogy nagyszámú párhuzamos mérést tesz lehetővé egy bioszenzor-hordozón belül (akár 100-1000 párhuzamos mérés egy lapkán). Egy ilyen eszközre egyre nagyobb igény van például a gyógyszeriparban, ahol a hatóanyag-vizsgálatok során a nagyszámú ellenőrző mérés elvégzése követelmény. Az SPRi mérési elv információt szolgáltat ezen felül a receptor-célmolekula bekötődéskinetikájáról, ami alapkutatás szinten rendkívül hasznos a bioreceptor rétegek érzékenységének optimalizálásában.
A labor korszerű eszközparkkal rendelkezik az elektromos, kémiai és elektrokémiai mérések elvégzéséhez is. A számos elektromos mérőeszköz és kémiai laborkészülék mellett, professzionális tapintó és érintésmentes hőmérsékletérzékelők, egy kesztyűsszekrény, valamint klímakamrák biztosítják a mérések kontrollált körülmények (hőmérséklet, nyomás, páratartalom) között történő végrehajtását. Az érzékelők által létrehozott villamos jelek feldolgozásához szükséges áramkörök fejlesztése szintén a labor kompetenciái közé tartozik.
Eddigi eredmények
Az elmúlt évek során folytatott kutató-fejlesztő munka eredményeként a laboratórium mára több, a maga nemében egyedülálló prototípussal büszkélkedhet.
A leginkább termék-orientált fejlesztés egy viselhető, vezeték nélküli pulzoximéteres érzékelőfej, mellyel a vizsgált alany véroxigén szintjét lehet folyamatosan nyomon követni. Az érzékelőfej fejlesztése mellett a projekt részét képezi az analóg és digitális áramkörök tervezése, a mikrokontroller programozása, valamint a kiértékelést végző számítógépes szoftver elkészítése is. Mindezek együttesen nem kisebb célt szolgálnak, mint a világ legkisebb vezeték nélküli pulzoximéteres érzékelőfejének elkészítését.
E pulzoximéter kapcsán a labor vezetője – Dr. Sántha Hunor – és egyik szenior kutatója – Dr. Stubán Norbert – egy spin-off céget is alapítottak 2007-ben Arvus Kft. néven [www.arvus.hu], azzal a küldetéssel, hogy a tanszék által inkubálva összegyűjtsék, és portfóliójuk részeként megjelenítsék a laborban születő olyan szellemi termékeket, melyekbe a BME nem kíván befektetni, de piacra vitelük további erőforrások (magánbefektető, pályázat, kockázati tőke) bevonásával mégsem teljesen reménytelen.
Egy további, viselhető vezeték nélküli orvosi érzékelő alkalmazás az Emberi EKG Rögzítő és Monitorozó Rendszer (HERMOS - Human ECG Recording and Monitoring System). A fejlesztés eredményeképp egy teljesen automatikusan működő, otthoni monitorozást lehetővé tevő rendszer jött létre. A felhasználónak mindössze fel kell helyeznie magára az EKG elektródákat és be kell kapcsolnia a készüléket. A mérési eredmények egy távoli JAVATM alkalmazásnak köszönhetően egy internetes böngészőablakban bármikor megtekinthetők. Az adatok a rendszer részét képező igen alacsony fogyasztású (0,5 W), mikrokontroller-alapú webszerveren tárolhatók, így az orvos az eredményeket egy laptopon, egy PDA-n vagy akár a mobiltelefonján is megtekintheti. A rendszer tesztelése eredményesen zárult egy 40 önkéntesből álló csoporton.
A jelölésmentes
bioérzékelési technológiák között kiemelt helyen szerepel, és egyre nagyobb
teret hódit a felületi plazmon-rezonancia spektroszkópia, amelynek segítségével
a felület közelében bekövetkező törésmutató változást lehet nagyon pontosan
nyomon követni. A Rapid-SPR elnevezésű nemzetközi projektben való aktív részvétel
eredményeként elkészült egy saját fejlesztésű, felületi plazmon-rezonanciás
képalkotó berendezés, amellyel az 50 nm-es aranyréteggel ellátott bioérzékelő
lapka több, mint 100, egymástól független területéről lehet párhuzamosan, valós
időben analitikai és kinetikai információt nyerni.
A készülék legnagyobb előnye – a kereskedelmi forgalomban kapható vetélytársaival szemben –, hogy a fluidikai cella – a hozzá tartozó termostabilizált befogóval együtt – rugalmasan átkonfigurálható, így a különböző mérési feladatokhoz más-más fluidikai cellát lehet használni, a labor eszközparkjában található 3D nyomtató segítségével pedig egy új cella megtervezése és legyártása akár egy napon belül megtörténhet. Az SPRi mérőberendezés, mint platformtechnológia alkalmas lehet tetszőleges fehérje (immunoérzékelő) vagy DNS alapú affinitás-bioérzékelő kutatására. A moduláris és rugalmasan átkonfigurálható fluidikai elemek lehetővé teszik a platform különböző igényekhez és feladatokhoz igazítását.
Az optikai technikákhoz képest egyszerűbb felépítése és kimagasló érzékenysége miatt a bioérzékelők kutatási és fejlesztési területén széles körben elterjedt módszer az elektrokémiai impedancia spektroszkópia (EIS).
A DVT-IMP nevű nemzetközi projekt keretein belül a labor kutatói sikeresen kifejlesztettek egy kézi EIS-mérő platformot, melynek legfontosabb tulajdonsága, hogy a mérés vezérlését, a görbe illesztést, valamint az adatfeldolgozást a készülékben található mikrokontroller végzi, így – a kereskedelemben kapható potenciosztátokkal ellentétben – sem emberi adatelőkezelés, sem számítógéppel történő kommunikáció nem szükséges az adatok kiértékeléséhez. Az EIS mérőeszköz, mint platformtechnológia alkalmas lehet tetszőleges fehérje (immunérzékelő) vagy DNS alapú affinitás-bioérzékelő kutatására.
A DINAMICS projekt keretein belül laborunk egy enzim tartalmú puffer oldat nélkül működő sejtlizáló berendezést fejlesztett ki. A sejt lizálása a sejtek genetikai információtartalmának kinyerése, azaz a sejtek felbontása oly módon, hogy a felszabaduló DNS valamint RNS molekulák további feldolgozás után detektálhatók legyenek. Az elkészült modul mind önállóan, mind a rendszer részeként alkalmazható. Előnye, hogy automatizált rendszerekbe könnyen beépíthető. A berendezés validálása a projekt során különböző humán patogénékkel (Gram-pozitív és Gram-negatív baktérium, vírus) történt, és a gyakorlatban alkalmazott módszerekkel megegyező hatékonyságot mutatott.
Minden mikrofluidikai rendszer fejlesztésének célja, hogy olyan eszköz készüljön, amely integráltan tartalmaz mintavevő, feldolgozó, kiértékelő egységet. Ez az úgynevezett lab-on-a-chip (LoC) koncepció, azaz egyetlen kisméretű mikrofluidikai eszközbe integrált mikrolaborok.
Az Érzékelők és mikrofluidika laboratórium valamint a GenoID Kft. fejlesztői a hazai Jedlik Ányos pályázati programon belül közösen kifejlesztettek egy mikrofluidikai kazettán alapuló általános biológiai mintafeldolgozó egységet. A kazetta kézzel működtethető, és négy, korábban megoldatlan területen kínál előrelépést:
1. párhuzamosan stabilizálja a mintakomponenseket (DNS, RNS, fehérje),
2. ellenőrzi a mintafeldolgozás lépéseit,
3. a biológiai mintákat alkalmassá teszi az un. profiling technológiák számára (nagy párhuzamosságú/teljes keresztmetszeti képet adó biológiai mérések). A stabilizált mintakomponensek kezelhetővé válnak az orvosi alkalmazások széles köre számára is (real-time PCR, cDNS expressziós profiling, tömegspektrometriás fehérje profiling).
4. lehetővé teszi a biztonságos mintagyűjtést és a mintaszennyeződést kizáró módon történő önmintavételt. A készülék megoldást kínál egyéb, biológiai mintát igénylő területek számára is.
Az első prototípusok funkciói egy konkrét orvosi alkalmazásban is tesztelésre kerültek már (HPV kimutatása méhnyakkenetből).
A fent említetteken túl, néhány további kisebb lélegzetű kutatás-fejlesztési munka folyik a laborban több neves európai kutatóintézettel, egyetemmel együttműködésben.
Várható impakt, további kutatás
Az elkészült platformtechnológiák komoly kiindulási alapot jelenthetnek további rendszerek fejlesztéséhez.
Napjainkra az egyszer használatos Point-of-Care biominta-elemzések piacán a személyi glükózmérők eldobható rácseppentős tesztcsíkjaihoz képest a mintakezelés két további evolúciós lépésen jutott túl. További két evolúciós lépés lesz szükséges a fentieknél komplexebb mintakezelést és reagáltatási/mérési protokollt igénylő elemzések Point-of-Care változataihoz: 3. aktív mintakezelés a készülékbe épített mikropumpa(ák) segítségével, 4. megbízható, de egyszer használatos, eldobható eszközökben is használható származó szelepek. A kifejlesztett EIS alapú kézi multi-bioérzékelő platformunk jelenleg a 3. evolúciós szinten áll, és egy jelenleg is futó hazai GOP keretprogramú Jedlik Ányos pályázat keretei között fejlesztünk egy rendszert, amely a 4. evolúciós lépést is magába foglalja.
Az SPRi mérőberendezésünk alkalmas lehet tetszőleges fehérje- (immunoérzékelő) vagy DNS-alapú affinitás-bioérzékelő kutatására. A moduláris és rugalmasan átkonfigurálható fluidikai elemek lehetővé teszik a platform különböző igényekhez és feladatokhoz igazítását . Egy kb. 15 x 15 mm2-es felületen több, akár 20 x 20 = 400 miniatűr, független reakcióteret építhetünk fel úgy, hogy az egymástól szeparált reakcióterekre különböző biomolekulákat (pl. fehérje, nukleotid fragmentumokat) mint receptorokat rögzítünk kémiai kötéssel, és e reakcióterekbe mikrofluidikai csatornákon vagy robotizált mikrocseppentési technikával bejuttatva a vizsgálat tárgyát képező célmolekulákat, azok lekötődési képességét/hajlamát vizsgáljuk.
Saját publikációk, hivatkozások, linkgyűjtemény
5 kiemelt publikáció az elmúlt 5 évből:
1. Attila Bonyár, Hunor Sántha, Comparison of electrode setups for a custom built
electrochemical measurement platform for DNA based biosensors, Megjelent: 1st Bio-sensing Technology Conference.
Bristol, Anglia, 2009.11.10-2009.11.12. Paper
P2.3.12.
Teljes dokumentum, DOI: 10.1016/j.proeng.2010.09.105
3. Attila Bonyár, Gábor Harsányi, AFM nanoshaving: a novel prospect for the
structural comparison of bioreceptor layers, Megjelent: Proc of the 34th International Spring
Seminar on Electronics Technology. Tatranska Lomnica, Szlovákia,
2011.05.12-2011.05.15. IEEE, Paper G02.
4. Szabadalom: Sántha H.,
Harsányi G., Stubán N., Microfluidic channel, method for its
implementation, and microfluidic system containing said channel, Lajstromszám: WO2009047573, Közzététel
éve: 2009, Benyújtás helye:
Magyarország
5.Khadro B, Santha H, Nagy P, Harsanyi G, Jaffrezic-Renault N, Comparison of the Performances of Conductometric Microsensors for Different Technologies and Designs of Interdigitated Electrodes, SENSOR LETTERS 6:(3) 413–416. (2008), IF: 1.160, WoS link, Teljes dokumentum, DOI: 10.1166/sl.2008.060
valamint az azt megelőző időszak 5 kiemelt publikációja:
1. Sántha H, Viewpoint - Medical sensors used for monitoring and diagnosis, SENSOR REVIEW 25:(4) 237–238, (2005)
2. Sántha, H., Dobay,
R., Harsányi, G., Amperometric uric acid biosensors fabricated of various types
of uricase enzymes, IEEE SENSORS JOURNAL
3:(3) 282–287. (2003), WoS link, DOI: 10.1109/JSEN.2003.814655
3. Harsányi, G., Sántha, H., Polytronics for Biotronics: Unique Possibilities of Polymers in
Biosensors and BioMEMS? Megjelent: 2nd International IEEE Conference on Polymers and
Adhesives in Microelectronics and Photonics. Zalaegerszeg, Magyarország,
2002.06.23-2002.06.26. IEEE, 211–215.
4. Harsányi G, Ballun G,
Bojta P, Gordon P, Sántha H, Multimedia for MEMs Technologies and Packaging Education,
MST NEWS 5: 10–12. (2003)
5. Sántha, H., Harsányi,
G., Sinkovics, B., Makai, D., A Microfluidic Electrochemical Cell Based on Microsystem
Packaging Technologies Applicable for Biosensor Development, Megjelent: 55th IEEE Electronic Components and Technology
Conference. Lake Buena Vista, Amerikai Egyesült Államok
IEEE, 588–592.
Érzékelők
és mikrofluidika labor
 |
 |
 |
 |
 |
 |